貨號(hào)：L6090L

品名：E. coli DNA Ligase（大腸桿菌DNA連接酶）

產(chǎn)品描述：

大腸桿菌 DNA連接酶催化DNA末端的相鄰5'磷酸和3'羥基之間形成磷酸二酯鍵，需要NAD +和Mg 2+作為輔因子。相對(duì)于粘性DNA末端連接和缺口密封，平末端DNA的連接是非常低效的。

蛋白質(zhì)來(lái)源

大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒編碼大腸桿菌DNA連接酶的基因。

提供：

10 mM Tris-HCl
50 mM KCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
50% glycerol
pH 7.5 @ 25℃

隨附：

B6090 (10X E.coli DNA Ligase Reaction Buffer)

10X E.coli DNA Ligase Reaction Buffer (B6090):
300 mM Tris-HCl
40 mM MgCl2
260 uM NAD
10 mM DTT
0.5 mg/mL BSA

單位定義 
1單位定義為在25℃下30分鐘內(nèi)連接100ng DNA的片段的50％與粘性末端所需的大腸桿菌 DNA連接酶的量。

質(zhì)量控制分析

單位表征測(cè)定
單位活性使用2倍系列稀釋法測(cè)量。在1X反應(yīng)緩沖液中制備酶的稀釋液并加入到20μL含有雙鏈DNA的片段和1X反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)中。將反應(yīng)在25℃（室溫）孵育30分鐘，在冰上浸入，并在用溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠上分析。

蛋白質(zhì)濃度（OD 280）測(cè)量使用使用2.0mg / ml BSA樣品（Pierce Cat＃23209）標(biāo)準(zhǔn)化的Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)
在OD 280處分析2.0μL酶樣品，并用產(chǎn)品儲(chǔ)存溶液沖切。使用34,280的消光系數(shù)和73,606道爾頓的分子量將觀察到的3個(gè)重復(fù)樣品的平均測(cè)量結(jié)果轉(zhuǎn)換為mg / mL。

SDS-Page（物理純度評(píng)估）

將2.0μL酶溶液加載到變性的4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠上，該凝膠側(cè)翼為寬范圍的MW標(biāo)記和2.0μL的1:100稀釋的樣品。電泳后，將凝膠染色并比較樣品以確定物理純度。該測(cè)試的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)要求濃縮樣品中污染帶的總量不超過(guò)稀釋樣品中目的蛋白質(zhì)條帶的質(zhì)量，確認(rèn)濃縮樣品的純度大于99％。

污染測(cè)試

單鏈核酸外切酶活性

將含有10,000cpm放射性標(biāo)記的單鏈DNA底物和10μl酶溶液的50μL反應(yīng)物在37℃下溫育4小時(shí)，導(dǎo)致TCA可溶性計(jì)數(shù)的釋放小于2.0％。

雙鏈核酸外切酶活性將含有5,000cpm放射性標(biāo)記的雙鏈DNA底物10μl的50μL反應(yīng)液和在37℃下孵育4小時(shí)的酶溶液導(dǎo)致少于1.0％的TCA可溶性計(jì)數(shù)釋放。

雙鏈核酸內(nèi)切酶活性將含有0.5μgpBR322 DNA和100單位酶溶液的50μL反應(yīng)液在37℃下溫育4小時(shí)，結(jié)果通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，沒(méi)有視覺(jué)上可辨別的轉(zhuǎn)化為帶切口的環(huán)狀DNA。

大腸桿菌 16S rDNA污染測(cè)試
將酶溶液的重復(fù)樣品變性，并使用對(duì)應(yīng)于16S rRNA基因座的寡核苷酸引物，在TaqMan qPCR測(cè)定中篩選污染性大腸桿菌基因組DNA的存在。測(cè)試的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)是由3個(gè)重復(fù)的無(wú)模板對(duì)照樣品的平均值產(chǎn)生的閾值循環(huán)計(jì)數(shù)（C t）。基于無(wú)模板對(duì)照 Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，該測(cè)定的檢測(cè)限為<10拷貝基因組/樣品。

部分產(chǎn)品信息：

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