Jena Bioscience由德國(guó)馬普所(MPI)的分子生理學(xué)家于1998年共同創(chuàng)辦的生物公司，致力為的科研院所、醫(yī)院、制藥企業(yè)以及診斷試劑盒生產(chǎn)企業(yè)提供各類(lèi)試劑。在結(jié)構(gòu)學(xué)研究方面全面提供晶體篩選試劑盒、優(yōu)化試劑、工具和各類(lèi)耗材等。

jenabioscience PP-101說(shuō)明書(shū)

JBS dNTP-Mutagenesis Kit

JBS dNTP誘變?cè)噭┖?/h1>

dNTP類(lèi)似物的隨機(jī)誘變

 

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圖1：dPTP和8-Oxo-dGTP的結(jié)構(gòu)

圖2：誘變速率與PCR循環(huán)數(shù)的關(guān)系[Zaccolo 等。]

僅用于體外！

運(yùn)輸：在藍(lán)色冰上運(yùn)輸

儲(chǔ)存條件：在-20°C下儲(chǔ)存，
避免冷凍/融化循環(huán)，強(qiáng)烈建議在使用前等分修飾核苷酸

保質(zhì)期： 12個(gè)月

描述：
JBS誘變系列
在三十億年的進(jìn)化過(guò)程中，自然界通過(guò)反復(fù)反復(fù)的隨機(jī)誘變循環(huán)，然后通過(guò)體內(nèi)選擇編碼蛋白的功能，自然產(chǎn)生了過(guò)多的蛋白。在過(guò)去的二十年中，這個(gè)自然進(jìn)化的例子指導(dǎo)研究人員開(kāi)發(fā)了蛋白質(zhì)體外排列的策略。
在應(yīng)用的各種策略中，出現(xiàn)了三種主要的強(qiáng)大技術(shù)。

dNTP類(lèi)似物的隨機(jī)誘變
此方法基于通過(guò)PCR將誘變的dNTP類(lèi)似物（例如8-oxo-dGTP和dPTP）摻入擴(kuò)增的DNA片段中。僅在四種天然dNTP的存在下，通過(guò)第二個(gè)PCR步驟消除了誘變dNTP，致突變率高達(dá)20％。
→ JBS dNTP誘變?cè)噭┖校P-101

由Caldwell＆Joyce（1992）開(kāi)發(fā)的Error-Prone PCR進(jìn)行隨機(jī)誘變?cè)摲椒ㄔ谝餌NA聚合酶錯(cuò)誤率增加的條件下，利用PCR反應(yīng)在目的基因中引入了突變。易錯(cuò)PCR的誘變率在0.6-2.0％的范圍內(nèi)。
→ JBS Error-Prone套件＃PP-102

通過(guò)DNA
改組進(jìn)行隨機(jī)誘變 Stemmer（1994）開(kāi)發(fā)的DNA改組通過(guò)隨機(jī)分裂一個(gè)基因或一組相關(guān)基因來(lái)生成文庫(kù)，然后在自引發(fā)PCR反應(yīng)中重組片段。該方法允許重組來(lái)自不同相關(guān)基因的序列。誘變的總速率約為。0.7％。
→ JBS DNA改組試劑盒＃PP-103

Jena Bioscience現(xiàn)在在單獨(dú)的套件中提供了每種“即用型”技術(shù)所需的所有必要組件，并附有精簡(jiǎn)的文檔，可很大程度地提高成功率。

含量：
Taq聚合酶（紅色帽）
5單位/微升，40微升

誘變緩沖液（綠帽）
10x濃度，200μl

dNTP混合液（白色帽）
每個(gè)10 mM dNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），100μl

dPTP（黃色瓶蓋）
10 mM，40μl

8-oxo-dGTP（藍(lán)帽）
10 mM，40μl

PCR級(jí)水（白色瓶蓋）
2x 1毫升

dNTP類(lèi)似物
8-oxo-dGTP和dPTP的隨機(jī)誘變是誘變的dNTP類(lèi)似物，可使用Taq聚合酶通過(guò)PCR將其摻入DNA [Zaccolo 等。，Zang 等。]。
將8-Oxo-dGTP摻入模板腺嘌呤對(duì)面，產(chǎn)生兩個(gè)過(guò)渡突變：A→C：T→G。誘變的總速率約為 據(jù)報(bào)道有2％（圖2），其中A→C：T→G的比率約為1。1：1.5。

據(jù)報(bào)道，dNTP模擬物dPTP約為。誘變作用是8-oxo-dGTP的10倍（圖2）。dPTP誘導(dǎo)的突變以大約5：4：1：1的比率發(fā)生（A→G：T→C：G→A：C→T），總誘變率高達(dá)19％。
由8-Oxo-dGTP和/或dPTP誘導(dǎo)的隨機(jī)誘變?cè)趦刹絇CR過(guò)程中進(jìn)行。首先，在四種天然dNTP加誘變類(lèi)似物dPTP和/或8-Oxo-dGTP的存在下擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段。誘變速率可以通過(guò)PCR循環(huán)數(shù)輕松控制（圖2）。

然后，在不存在誘變類(lèi)似物的情況下，將首輪PCR的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR。該步驟在克隆和轉(zhuǎn)化之前從靶DNA中消除了非天然類(lèi)似物。

推薦的測(cè)定準(zhǔn)備

• 對(duì)于50μl反應(yīng)，請(qǐng)?jiān)跓o(wú)菌小瓶中加入5μl10x誘變緩沖液
• 添加多25 fmol模板DNA和0.2-1μM合適的引物
• 加入2.5μldNTP混合物
• 加入2.5μl每個(gè)誘變類(lèi)似物
• 加入1μl（5 u）Taq聚合酶
• 加入PCR級(jí)水至終體積為50μl

推薦的熱循環(huán)條件

變性	92°攝氏度	1分鐘
退火	55°攝氏度	1.5分
延期	72°攝氏度	5分鐘

循環(huán)數(shù)：5-30（請(qǐng)參見(jiàn)圖2）
。誘變的速率主要取決于循環(huán)數(shù)（圖2），并且可以通過(guò)誘變dNTP的數(shù)量進(jìn)行微調(diào)[Zaccolo 等。]。

 

終PCR
為了消除誘變性dNTP，在第二步PCR中使用等分的1μlPCR反應(yīng)作為模板。取10x誘變緩沖液，并按上述相同濃度添加模板，引物，dNTP Mix和Taq聚合酶。裝滿(mǎn)PCR級(jí)水至50μl。
使用相同的熱循環(huán)條件，但20-30個(gè)循環(huán)。

精選參考文獻(xiàn)：
Zang 等。（2006）而高保真度的dCTP與7,8-dihydro-8-oxodeoxyguanosine相對(duì)，通過(guò)sololotarius DNA聚合酶Dpo4。Journal of Biological Chemistry281：2358。
Zaccolo 等。（1999）高頻隨機(jī)誘變對(duì)體外蛋白質(zhì)進(jìn)化的影響：TEM-1β-內(nèi)酰胺酶的研究。J.摩爾 生物學(xué) 285（2）：775。
Crameri 等。（1998）DNA改組從不同種類(lèi)的基因家庭加速定向進(jìn)化。自然 391：288。
Zaccolo 等。（1996）一種使用核苷類(lèi)似物的三磷酸酯衍生物的混合物隨機(jī)誘變DNA的方法。J.摩爾 生物學(xué) 255：589。
Stemmer（1994）通過(guò)DNA改組在體外快速進(jìn)化蛋白質(zhì)。自然 370：389。
Cadwell 等。（1992）通過(guò)PCR誘變使基因隨機(jī)化。PCR方法。應(yīng)用 2：28。