Abwiz Bio，我們開發(fā)并優(yōu)化了一個三階段抗體親和力成熟平臺，該平臺涉及三個獨立的文庫構(gòu)建和選擇/篩選步驟。在每個篩選步驟之后，將工程克隆整合在一起，用于隨后的文庫構(gòu)建。在階段1中使用六個單獨的CDR靶向文庫可以使我們探索大的序列空間。在每個階段對工程克隆的篩選和測序，使我們能夠監(jiān)控進(jìn)度，并提供有用的信息，有助于后續(xù)的文庫設(shè)計。

由于每種抗體的起始親和力和序列以及抗原的性質(zhì)對于每個項目都不同，因此很難預(yù)先預(yù)測親和力成熟的一階段是否令人滿意，或者是否需要親和力成熟的第二和第三階段。因此，在每個階段的后，我們將介紹已完成的工作并與每個客戶進(jìn)行公開討論，以確保他們滿意并確定項目的后續(xù)步驟。

 STEAM（增強(qiáng)階段親和力成熟度）技術(shù)

abwizbio新穎的三階段工程平臺

我們的團(tuán)隊在設(shè)計用于基于噬菌體的選擇的合成文庫方面擁有數(shù)十年的集體經(jīng)驗。Abwiz Bio領(lǐng)導(dǎo)了多次成功的親和力成熟活動，為具有低納摩爾起始親和力的人，小鼠和兔抗體產(chǎn)生了> 10倍的親和力改善。我們已經(jīng)開發(fā)并驗證了一種穩(wěn)健的親和力成熟方案，該方案始于分別針對六個CDR進(jìn)行誘變。我們的多階段方法涵蓋了更多的多樣性，并產(chǎn)生了更高的親和力克隆，而這是傳統(tǒng)的方法（如CDR步移）無法實現(xiàn)的。

階段1	第二階段	第三階段
6個CDR靶向庫	L1 + L2 + L3和H1 + H2 + H3合并在單獨的庫中	組合式H + L
通過構(gòu)建針對每個CDR的獨立文庫，我們對大序列空間進(jìn)行了采樣	預(yù)先選擇的CDR庫合并在一起以創(chuàng)建單獨的LC / HC庫	終的文庫對預(yù)先選擇了重庫和輕庫，以獲得高的親和力克隆

依靠經(jīng)驗豐富的團(tuán)隊來設(shè)計您的圖書館

抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）與抗原形成大部分結(jié)合表面。CDR包含三個環(huán)，分別從每個抗體臂可變區(qū)內(nèi)的重鏈（CDR H1，H2和H3）和輕鏈（CDR L1，L2和L3）延伸。可以通過針對這些區(qū)域進(jìn)行誘變來改善親和力。但是，噬菌體展示的生物學(xué)限制（大大腸桿菌的限制轉(zhuǎn)換效率）將給定庫中可能的變體總數(shù)限制為?1E + 10。（與酵母展示相比，庫的大小要大得多，大?1E + 08）。對所有可能的變體隨機(jī)分配一個6個氨基酸的片段，可產(chǎn)生1.07E + 09的理論多樣性；因此，理論多樣性可以成倍地超過實際圖書館的多樣性。通過靶向單獨文庫中的每個CDR，可以針對階段1中的每個單獨環(huán)優(yōu)化抗原相互作用。

對于每個CDR，使用生物信息學(xué)方法選擇假定對于抗原結(jié)合而言不是理想的氨基酸。通過將您的序列與抗體種系和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，我們可以推斷出哪些位置可能已經(jīng)針對抗原結(jié)合進(jìn)行了優(yōu)化，哪些可以耐受突變。我們過去在成功開展人類和小鼠治療候選藥物方面的經(jīng)驗，也為我們的選擇提供了依據(jù)。我們將總文庫大小限制在理論多樣性極限內(nèi)，同時避免了會破壞全局抗體穩(wěn)定性的突變和程度地采樣序列圖。

抗原結(jié)合克隆的CDR H1和H2序列以序列徽標(biāo)格式顯示。值得注意的是，（1）僅在設(shè)計用于誘變的每個位置上發(fā)現(xiàn)了氨基酸；（2）與階段1相比，階段2克隆具有更強(qiáng)的序列收斂性；（3）在親和力成熟的庫中存在高度多樣性。

基于噬菌體的選擇的好處

噬菌體選擇非常靈活，可以調(diào)整以獲得所需的抗原特異性或親和力參數(shù)。選項包括（1）與陰性對照抗原競爭對交叉反應(yīng)性結(jié)合劑的陰性選擇；（2）通過以較低濃度包被抗原和/或通過改變孵育和洗滌時間進(jìn)行嚴(yán)格選擇，以進(jìn)行基于速率的動力學(xué)選擇，（3）抗原構(gòu)象特異性選擇與重組和基于細(xì)胞的抗原都兼容，后（4）噬菌體病毒在80°C穩(wěn)定，可以選擇熱穩(wěn)定的高表達(dá)克隆。

我們專有的載體與Fab噬菌體和可溶性Fab生產(chǎn)均兼容，可在噬菌體淘選后進(jìn)行快速篩選。選擇后，產(chǎn)生數(shù)百個隨機(jī)挑選的克隆，并從細(xì)菌上清液中篩選為可溶性Fab。在進(jìn)入昂貴，費時的IgG生產(chǎn)階段之前，篩選高通量的潛在候選基因可以節(jié)省大量時間和資源。除了全序列分析外，還可以通過ELISA，流式細(xì)胞儀，功能分析和SPR高通量篩選針對重組蛋白或基于細(xì)胞的蛋白的Fab 。

我們的協(xié)議已經(jīng)過嚴(yán)格驗證

我們的三階段工程策略被用于提高與識別潛在癌癥靶標(biāo)的候選抗體候選物的親和力。在每個階段鑒定的工程克隆的測序分析為我們的3階段策略提供了有力的支持。

篩選過程中鑒定出的*CDR數(shù)如下所示。（CDR數(shù)）/（CDR總數(shù)）顯示每個篩選階段每個CDR的所選克隆的序列多樣性。

在先前的選擇回合中識別出的CDR的數(shù)量如下所示。這顯示了具有先前在階段1（或階段1和2）中鑒定的CDR序列的克隆數(shù)。

在每個階段的篩選步驟中均一致鑒定出*的CDR序列。傳統(tǒng)的CDR步移協(xié)議 （在繼續(xù)設(shè)計下一個CDR之前，從單個文庫中選擇宜CDR克隆），而不是使用我們的方法來組合整個預(yù)選CDR庫以進(jìn)行其他文庫選擇，將無法確定宜方法。候選人。這些數(shù)據(jù)為我們的三階段工程策略提供了有力的支持。

展示成功

申請治療

在一個客戶項目中，我們成功地將親和力提高了10倍，與pM K D的結(jié)合力提高了，同時又增加了候選治療藥物的功能。使用了兩階段方法（單個CDR→組合的H + L文庫），并且在進(jìn)一步的臨床研究之前就宜工程克隆的序列。

與親本野生型相比，工程化Fab的解離速率更慢，這表明通過SPR分析提高了親和力。

提供給客戶數(shù)十名工程候選人

在另一個客戶項目中，我們通過詳盡的3階段方法（單個CDR→單獨的H + L→組合的H + L庫）將親和力提高了10-100倍。我們向客戶提供了23個經(jīng)過工程設(shè)計的候選物用于IgG功能篩選，每個候選物具有*的序列并大大提高了親和力。

上面顯示了在每個工程階段之后進(jìn)行的Fab篩選的克隆。第1階段克隆顯示出比野生型更高的親和力，但仍保留更快的解離速率。從第2階段庫獲得較低的失效率。只有在第3階段工程后才能獲得具有飽和結(jié)合和非常慢的脫模速率的克隆。

我們靈活的平臺可滿足您的需求

僅在第1階段工程（單個CDR庫）或第2階段（僅重鏈或輕鏈庫）后，才能確定親和力的充分提高。在一個項目中，我們的客戶對第2階段后的結(jié)果感到滿意。我們的靈活平臺包括每個工程階段之后的Fab特性鑒定，從而使我們的客戶可以通過在多個點評估項目成果來節(jié)省時間和資源。這使我們能夠快速提供結(jié)果，并根據(jù)需要調(diào)整我們的工程方法。

測試了階段2克隆針對親本野生型Fab和非速率ELISA中宜階段1工程改造的克隆。選自第2階段文庫的突變可顯著改善親和力。

項目時間表

我們開始設(shè)計您的文庫所需要的只是抗體的氨基酸序列。一步，合成用于文庫構(gòu)建的抗體基因和寡核苷酸，通常在基因合成后約2個月完成階段1工程。第2階段和第3階段分別可以在4-6周內(nèi)完成，因為它們可以立即進(jìn)行庫合成步驟。因為每個項目都是*的，所以我們在每個階段的開始都與每個客戶緊密合作，以仔細(xì)審查先前的篩選數(shù)據(jù)并制定可靠的計劃。